高效液相色譜、串聯(lián)質(zhì)譜法檢測中藥材中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量
點擊: 次 時間:2017-05-22 10:59
摘要:研究了中藥材中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的高效液相色譜..串聯(lián)質(zhì)譜同步檢測方法。采用CAPCELLPAKMGC18反相柱,以乙腈為提取溶液,以Carb/PSA柱為凈化柱,液相色譜..串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。方法線性范圍為10~500..g/L,11種有機(jī)磷農(nóng)藥在此范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)為0..9961~0..9999。在10~100..g/kg濃度范圍內(nèi),加標(biāo)回收率在70%~110%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1..4%~11%,最低檢出限為2~20..g/kg,符合殘留檢測分析要求。
關(guān)鍵詞:高效液相色譜..串聯(lián)質(zhì)譜;中藥材;有機(jī)磷農(nóng)藥;多農(nóng)藥殘留
有機(jī)磷農(nóng)藥大量使用會在農(nóng)作物中產(chǎn)生蓄積，作用,對人畜構(gòu)成威脅,也會對環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響。目前,我國中藥材中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留分析研究，較少[1~3],使用較多的檢測方法為氣相色譜法[4],，也有使用氣質(zhì)聯(lián)用法[5],但較少使用液質(zhì)聯(lián)用法。由于大多數(shù)中藥材成分復(fù)雜,對于復(fù)雜樣品多殘留痕量分析,氣相色譜和氣質(zhì)連用抗干擾能力較差,對樣品前處理技術(shù)要求較高,而高效液相色譜..串聯(lián)質(zhì)譜儀可以進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,抗干擾能力較強(qiáng),對前處理要求較低。通過選擇監(jiān)測離子對一些成分復(fù)雜、背景較..臟..的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析,比較適合中藥材中農(nóng)藥多殘留檢測分析。本研究采用固相萃取凈化結(jié)合高效液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜檢測的方法建立了梔子、玄參、車前草、甘草及金銀花等中藥材中11種有機(jī)磷農(nóng)藥的多殘。
檢測方法
1..實驗部分
1..儀器與材料
液相色譜..三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀;粉粹機(jī);臺式，離心機(jī)(最高轉(zhuǎn)速4500r/min);超聲波清洗器;氮氣吹干儀;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;旋渦混合器;固相萃，取儀。甲醇和乙腈均為色譜純;甲苯、丙酮、無水硫酸，鈉為分析純;甲酸:純度>98%;活性炭;Carb/PSA雙層固相萃取柱(500mgCarb/500mgPSA/6mL)。標(biāo)準(zhǔn)品:敵敵畏;地蟲硫磷;殺撲磷;二嗪磷;甲基嘧啶磷;甲基谷硫磷;馬拉硫磷;毒死蜱;毒蟲畏;伏殺硫磷;乙硫磷。丙酮配制標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(100mg/L)。實驗藥材:梔子、玄參、車前草、甘草及金銀花。
2..樣品提取
稱取粉碎、過0..45mm篩后的中藥材樣品5..0g于50mL塑料離心管中,加入30mL乙腈,加入5g無水硫酸鈉,蓋上蓋子,用手劇烈震蕩使其混合均勻,超聲30min,3500r/min離心5min,取15mL上清液于100mL梨形瓶中,35..下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,待凈化。
3..樣品凈化
在Carb/PSA柱中加入0..5g活性炭,預(yù)先用4mL乙腈..甲苯(體積比為3:1)活化小柱,用10mL
乙腈..甲苯(體積比為3:1)分三次溶解蒸干后殘過柱,收集流出液,用20mL乙腈..甲苯(體積比為3:1)洗脫,收集流出液,合并流出液于平底燒中,35..下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0..5mL左右,氮氣吹干,用1mL乙腈溶解,過0..22..m濾膜后測定。
1..4..液相色譜條件
色譜柱:CAPCELLPAKMGC18柱(100mm.2..0mm.id.,3..m);柱溫:室溫;流速:200..L/min;進(jìn)樣體積:10..L;流動相:V(0..1%甲酸水溶液):V(甲醇)=50:50,0~3min甲醇比例從50%線性增加至95%,然后保持4..5min,7..5~8min,線性恢復(fù)至初始流動相比例,然后平衡2min。
1..5..質(zhì)譜分析條件
離子源:電噴霧離子化源(ESI);掃描模式:正離子模式;檢測方式:選擇反應(yīng)檢測(SRM);電噴霧電壓:4000V;毛細(xì)管溫度:350..;碰撞氣:高純度氬氣;監(jiān)測離子及對碰撞能量見表1。表1..ESI..MS/MS監(jiān)測離子及對應(yīng)碰撞能量有機(jī)磷農(nóng)藥母離子
1..6..線性關(guān)系考察實驗準(zhǔn)確吸取適量各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲備液,用空白品提取液在10~500..g/L范圍內(nèi)稀釋成一系列不同濃度梯度,在選定的最佳液..質(zhì)分離條件下進(jìn)行測定,以樣品中各有機(jī)磷農(nóng)藥的峰面積為縱坐標(biāo),含量(..g/L)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1..7..回收率和精密度實驗
稱取5種中藥材各5..0g,分別在10、50、100g/kg三個濃度下進(jìn)行空白樣品加標(biāo)實驗,分別按1..3中方法操作,每個濃度重復(fù)5次,測得平均回收率和精密度。
2、結(jié)果與討論
2..1..色譜條件..
液質(zhì)聯(lián)用所用流動相中不能加入各種表面活性劑、難揮發(fā)鹽及其他對質(zhì)譜響應(yīng)有抑制作用的物質(zhì),流動相可選范圍較小,常用的為甲醇、乙腈、及其不同比例的混合物和一些易揮發(fā)性鹽的緩沖液。本研究考察了甲醇..水溶液流動相體系,實驗過程中加入適量的乙酸銨和甲酸,實驗結(jié)果表明,在甲醇..水溶液中加入0..1%的甲酸有助于有機(jī)磷農(nóng)藥的離子化,響應(yīng)值高。同時為了進(jìn)一步改善峰形,縮短分析時間,采用了梯度洗脫,11種有機(jī)磷農(nóng)藥均在7min之內(nèi)出峰,峰形良好,詳見圖1。
2..2..質(zhì)譜條件..
在ESI正離子模式下,所有物質(zhì)均有良好響應(yīng),可同時觀察到其準(zhǔn)分子離子峰。在對準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二次質(zhì)譜優(yōu)化時又得到其碎片離子及各自的碰撞能量,選擇碎片離子作為定性定量依據(jù)(見表1),保證了靈敏度和準(zhǔn)確性。
2..3..樣品提取劑..
有機(jī)磷農(nóng)藥具有一定極性,不同文獻(xiàn)報道的取溶劑有所不同,本實驗分別考察了乙酸乙酯、乙腈、丙酮、二氯甲烷和正己烷5種提取溶劑對11種有機(jī)磷農(nóng)藥的提取效率,結(jié)果表明,乙腈和二氯甲烷提取效率較高,但二氯甲烷提取的共提物較多,雜質(zhì)干擾大,因此實驗選擇乙腈作為提取溶劑。
2..4..凈化方式..
實驗分別選擇活性炭、C18、SAX、Carb/PSA固相萃取柱凈化,結(jié)果表明,Carb/PSA固相萃取柱的凈化效果較理想,而且可以保證11中有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率均在70%以上。對于色素含量高的樣品,在小柱中加入一定量的活性炭脫色效果更好。
2..5..線性關(guān)系和最低檢出限..
按1..6方法操作,結(jié)果表明,5種中藥材中11種有機(jī)磷農(nóng)藥在10~500..g/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,梔子、車前草、玄參、甘草及金銀花中11種有機(jī)磷農(nóng)藥的線性相關(guān)系數(shù)為0..9961~0..9999。在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品做檢出限實驗,以信噪比大于3為依據(jù),確立了方法的最低檢出限,五種中藥材中11種有機(jī)磷農(nóng)藥的最低檢出限為2~20..g/kg,詳見表2。
2..6..回收率和精密度..
按1..7方法操作,測得平均回收率和精密度,結(jié)果表明:在10~100..g/kg濃度范圍內(nèi),梔子中11種有機(jī)磷農(nóng)藥平均回收率為84..0%~104..7%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1..4%~9..4%;車前草中有機(jī)磷農(nóng)藥平均回收率為71..6%~87..8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2..7%~11%;玄參中有機(jī)磷農(nóng)藥平均回收率為73%~110%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1..8%~7..8%;甘草中有機(jī)磷農(nóng)藥平均回收率為70%~86..5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3..3%~9..5%;金銀花中有機(jī)磷農(nóng)藥平均回收率為72..5%~96..8%,相對平均偏差為2..2%~9..1%。
2..7..樣品檢測..
利用本文建立的方法對從6家藥材店買回的，梔子、車前草、玄參、甘草及金銀花等28個樣品進(jìn)行了檢測,均未檢出有機(jī)磷農(nóng)藥,并將本方法用于出口牛蒡中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量檢測,2009年共檢測牛蒡樣品284個,均未檢出有機(jī)磷農(nóng)藥。
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關(guān)鍵詞:高效液相色譜..串聯(lián)質(zhì)譜;中藥材;有機(jī)磷農(nóng)藥;多農(nóng)藥殘留
有機(jī)磷農(nóng)藥大量使用會在農(nóng)作物中產(chǎn)生蓄積，作用,對人畜構(gòu)成威脅,也會對環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響。目前,我國中藥材中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留分析研究，較少[1~3],使用較多的檢測方法為氣相色譜法[4],，也有使用氣質(zhì)聯(lián)用法[5],但較少使用液質(zhì)聯(lián)用法。由于大多數(shù)中藥材成分復(fù)雜,對于復(fù)雜樣品多殘留痕量分析,氣相色譜和氣質(zhì)連用抗干擾能力較差,對樣品前處理技術(shù)要求較高,而高效液相色譜..串聯(lián)質(zhì)譜儀可以進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,抗干擾能力較強(qiáng),對前處理要求較低。通過選擇監(jiān)測離子對一些成分復(fù)雜、背景較..臟..的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析,比較適合中藥材中農(nóng)藥多殘留檢測分析。本研究采用固相萃取凈化結(jié)合高效液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜檢測的方法建立了梔子、玄參、車前草、甘草及金銀花等中藥材中11種有機(jī)磷農(nóng)藥的多殘。
檢測方法
1..實驗部分
1..儀器與材料
液相色譜..三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀;粉粹機(jī);臺式，離心機(jī)(最高轉(zhuǎn)速4500r/min);超聲波清洗器;氮氣吹干儀;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;旋渦混合器;固相萃，取儀。甲醇和乙腈均為色譜純;甲苯、丙酮、無水硫酸，鈉為分析純;甲酸:純度>98%;活性炭;Carb/PSA雙層固相萃取柱(500mgCarb/500mgPSA/6mL)。標(biāo)準(zhǔn)品:敵敵畏;地蟲硫磷;殺撲磷;二嗪磷;甲基嘧啶磷;甲基谷硫磷;馬拉硫磷;毒死蜱;毒蟲畏;伏殺硫磷;乙硫磷。丙酮配制標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(100mg/L)。實驗藥材:梔子、玄參、車前草、甘草及金銀花。
2..樣品提取
稱取粉碎、過0..45mm篩后的中藥材樣品5..0g于50mL塑料離心管中,加入30mL乙腈,加入5g無水硫酸鈉,蓋上蓋子,用手劇烈震蕩使其混合均勻,超聲30min,3500r/min離心5min,取15mL上清液于100mL梨形瓶中,35..下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,待凈化。
3..樣品凈化
在Carb/PSA柱中加入0..5g活性炭,預(yù)先用4mL乙腈..甲苯(體積比為3:1)活化小柱,用10mL
乙腈..甲苯(體積比為3:1)分三次溶解蒸干后殘過柱,收集流出液,用20mL乙腈..甲苯(體積比為3:1)洗脫,收集流出液,合并流出液于平底燒中,35..下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0..5mL左右,氮氣吹干,用1mL乙腈溶解,過0..22..m濾膜后測定。
1..4..液相色譜條件
色譜柱:CAPCELLPAKMGC18柱(100mm.2..0mm.id.,3..m);柱溫:室溫;流速:200..L/min;進(jìn)樣體積:10..L;流動相:V(0..1%甲酸水溶液):V(甲醇)=50:50,0~3min甲醇比例從50%線性增加至95%,然后保持4..5min,7..5~8min,線性恢復(fù)至初始流動相比例,然后平衡2min。
1..5..質(zhì)譜分析條件
離子源:電噴霧離子化源(ESI);掃描模式:正離子模式;檢測方式:選擇反應(yīng)檢測(SRM);電噴霧電壓:4000V;毛細(xì)管溫度:350..;碰撞氣:高純度氬氣;監(jiān)測離子及對碰撞能量見表1。表1..ESI..MS/MS監(jiān)測離子及對應(yīng)碰撞能量有機(jī)磷農(nóng)藥母離子
1..6..線性關(guān)系考察實驗準(zhǔn)確吸取適量各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲備液,用空白品提取液在10~500..g/L范圍內(nèi)稀釋成一系列不同濃度梯度,在選定的最佳液..質(zhì)分離條件下進(jìn)行測定,以樣品中各有機(jī)磷農(nóng)藥的峰面積為縱坐標(biāo),含量(..g/L)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1..7..回收率和精密度實驗
稱取5種中藥材各5..0g,分別在10、50、100g/kg三個濃度下進(jìn)行空白樣品加標(biāo)實驗,分別按1..3中方法操作,每個濃度重復(fù)5次,測得平均回收率和精密度。
2、結(jié)果與討論
2..1..色譜條件..
液質(zhì)聯(lián)用所用流動相中不能加入各種表面活性劑、難揮發(fā)鹽及其他對質(zhì)譜響應(yīng)有抑制作用的物質(zhì),流動相可選范圍較小,常用的為甲醇、乙腈、及其不同比例的混合物和一些易揮發(fā)性鹽的緩沖液。本研究考察了甲醇..水溶液流動相體系,實驗過程中加入適量的乙酸銨和甲酸,實驗結(jié)果表明,在甲醇..水溶液中加入0..1%的甲酸有助于有機(jī)磷農(nóng)藥的離子化,響應(yīng)值高。同時為了進(jìn)一步改善峰形,縮短分析時間,采用了梯度洗脫,11種有機(jī)磷農(nóng)藥均在7min之內(nèi)出峰,峰形良好,詳見圖1。
2..2..質(zhì)譜條件..
在ESI正離子模式下,所有物質(zhì)均有良好響應(yīng),可同時觀察到其準(zhǔn)分子離子峰。在對準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二次質(zhì)譜優(yōu)化時又得到其碎片離子及各自的碰撞能量,選擇碎片離子作為定性定量依據(jù)(見表1),保證了靈敏度和準(zhǔn)確性。
2..3..樣品提取劑..
有機(jī)磷農(nóng)藥具有一定極性,不同文獻(xiàn)報道的取溶劑有所不同,本實驗分別考察了乙酸乙酯、乙腈、丙酮、二氯甲烷和正己烷5種提取溶劑對11種有機(jī)磷農(nóng)藥的提取效率,結(jié)果表明,乙腈和二氯甲烷提取效率較高,但二氯甲烷提取的共提物較多,雜質(zhì)干擾大,因此實驗選擇乙腈作為提取溶劑。
2..4..凈化方式..
實驗分別選擇活性炭、C18、SAX、Carb/PSA固相萃取柱凈化,結(jié)果表明,Carb/PSA固相萃取柱的凈化效果較理想,而且可以保證11中有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率均在70%以上。對于色素含量高的樣品,在小柱中加入一定量的活性炭脫色效果更好。
2..5..線性關(guān)系和最低檢出限..
按1..6方法操作,結(jié)果表明,5種中藥材中11種有機(jī)磷農(nóng)藥在10~500..g/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,梔子、車前草、玄參、甘草及金銀花中11種有機(jī)磷農(nóng)藥的線性相關(guān)系數(shù)為0..9961~0..9999。在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品做檢出限實驗,以信噪比大于3為依據(jù),確立了方法的最低檢出限,五種中藥材中11種有機(jī)磷農(nóng)藥的最低檢出限為2~20..g/kg,詳見表2。
2..6..回收率和精密度..
按1..7方法操作,測得平均回收率和精密度,結(jié)果表明:在10~100..g/kg濃度范圍內(nèi),梔子中11種有機(jī)磷農(nóng)藥平均回收率為84..0%~104..7%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1..4%~9..4%;車前草中有機(jī)磷農(nóng)藥平均回收率為71..6%~87..8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2..7%~11%;玄參中有機(jī)磷農(nóng)藥平均回收率為73%~110%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1..8%~7..8%;甘草中有機(jī)磷農(nóng)藥平均回收率為70%~86..5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3..3%~9..5%;金銀花中有機(jī)磷農(nóng)藥平均回收率為72..5%~96..8%,相對平均偏差為2..2%~9..1%。
2..7..樣品檢測..
利用本文建立的方法對從6家藥材店買回的，梔子、車前草、玄參、甘草及金銀花等28個樣品進(jìn)行了檢測,均未檢出有機(jī)磷農(nóng)藥,并將本方法用于出口牛蒡中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量檢測,2009年共檢測牛蒡樣品284個,均未檢出有機(jī)磷農(nóng)藥。
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